Caracterización del dominio carboxilo-terminal de la GTPasa de bucle GPN Npa3 en Saccharomyces cerevisiae.

Caracterización del dominio carboxilo-terminal de la GTPasa de bucle GPN Npa3 en Saccharomyces cerevisiae.

La GTPasa de bucle Gpn1 en la levadura Saccharomyces cerevisiae (Npa3) participa en el ensamblaje de las diferentes subunidades de la RNA polimerasa II (RNAPII), un proceso que ocurre en el citoplasma y que es esencial para la subsecuente importación nuclear de la enzima. Npa3 posee un dominio de GTPasa con una extensión en su dominio carboxilo-terminal (C-terminal) presente únicamente en eucariontes, y ausente en el ortólogo de arqueas. Previamente, nuestro grupo reportó que el C-terminal en Npa3 tiene funciones no relacionadas con la RNAPII, debido a que células expresando una versión trunca de Npa3 carente de los últimos 106 aminoácidos del C-terminal (npa3∆C) mostraron una localización nuclear normal para la RNAPII, pero una mayor sensibilidad a los inhibidores de síntesis de proteínas higromicina B y geneticina. Asimismo, un análisis de matrices genéticas sintéticas arrojó que la mutante npa3∆C tenía una fuerte interacción genética negativa con genes participantes en diferentes procesos celulares, particularmente con la mutante bud27∆. A pesar de esto, se conoce muy poco sobre la estructura y regulación de la función del C-terminal de Npa3. En este trabajo, se muestra que los extremos C-terminal de Npa3 y de Gpn1 humana tienen características estructurales propias de regiones intrínsecamente desordenadas con tres motivos de reconocimiento molecular (MoRFs). Inesperadamente, no existe ninguna identidad en la secuencia primaria entre ambos C-terminal y, a pesar de esto, el C-terminal de Gpn1 reemplazó parcialmente la función del C-terminal de Npa3 en la levadura S. cerevisiae. Adicionalmente, se ha reportado en estudios globales de proteómica que Npa3 se fosforila en once residuos de su C-terminal, pero se desconoce la relevancia fisiológica de esta modificación postraduccional. Células de levadura bud27∆ que expresan una versión no fosforilable de Npa3 (npa3-NP) con ocho de los once residuos fosforilables mutados a alanina, y por lo tanto incapaces de ser fosforilados, mostraron una mayor sensibilidad a la higromicina B y a la cicloheximida que las células control. El mismo fenotipo se observó mutando únicamente el grupo Ser304/Ser308/Ser313 a alanina. En conclusión, en este trabajo se propone que la función del dominio de GTPasa en Npa3 se regula fuertemente por la fosforilación de su extremo C-terminal, una región intrínsecamente desordenada. Nuestros resultados apoyan la propuesta de que Npa3 cumple alguna función en la síntesis de proteínas, muy probablemente en algún proceso molecular en el que también participa Bud27.